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使目的基因稳定表达为啥要借助质粒？
点击次数：364 发布时间：2022/9/16 10:55:28
（1）转化是指目的基因进人受体细胞内，并在受体细胞内维持稳定和表达的过程
（2）①启动子是一段特殊结构的DNA/片段，位于基因的端，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，终获得所需要的蛋白质．
②tms基因能够编码生长素，tmr基因能够编码细胞分裂素，这两种激素能够促进植物的生长．因此人工改造时用限制酶Ⅰ处理，其目的是除去或破坏质粒上的tmr、tms，保/证T-DNA进入水稻细胞后不会引起细胞的无限分裂和生长；另外只有一个插入位点，也有利于目的基因（或外源DNA）准确插入．
③若用限制酶Ⅱ切割改造过的理想质粒，质粒上的抗四环素的标记基因（tet）就会破坏，所以以含四环素和卡那霉素的培养基培养后，在含卡那霉素的培养基能够生长，而在含四环素的培养基中不能生长．
故答案为：
（1）转化
（2）①启动子
②tms和tmr 目的基因（或外源DNA）准确插入
③在含卡那霉素的培养基中能够生长，而在含四环素的培养基中不能生长
质粒如何提取？
1. 质粒转化
具体操作步骤：
将1u质粒DNA加入1.5ml的离心管；
将感受态细菌（competent cells）从－70℃冰柜中取出，快速吸取50ul感受态细菌，加入含质粒DNA的1.5ml的离心管；
轻轻地旋转以混匀内容物，在冰中放置30～60 min；
42度热休克90s（该时间应该非常准确，用Timer记时），冰上放置5min；
每管加500uLB培养液，放37℃水浴1h；
吸取200ul培养物至含相应抗生素的90mm LB平板上，涂布棒将培养液涂布均匀；
倒置平皿，于37℃培养，12～16h后可出现菌落。
2. 质粒的抽提
具体操作步骤：
用将RNase A管的液体全部加到 SolutionⅠ（加好RNaseA的溶液I一般储存在4℃）；
将60ml的乙醇加到洗涤缓冲液瓶
37℃培养16h的平板中挑取一个单菌落（直径2～3mm），接种到10mLB培养液 37℃剧烈振摇培养16 h；
取4ml菌液到5m离心管，8000rpm室温离心3min；
去上清，放于面巾纸上吸干痕液，
加250 uSolution Ⅰ（注意用应该加RNase A管），于涡旋振荡器重悬细胞；
加250 u37℃预热2-3min的Solution Ⅱ；
加350 uSolution Ⅲ，将5ml离心管置于拇指和食指间柔和地反复颠倒数次；
将5ml离心管中的溶液倒入1.5m离心管中，
室温孵育2-3min，12000rpm 4℃离心15 min；
装配2m收集管（白色）和柱状收集管（蓝色）
将上清倒入柱状收集管（蓝色）中；
8000rpm室温离心3min；
去掉收集管中的液体，加500uBuffer HB 到柱状收集管中，10000rpm室温离心1min；
去掉柱状收集管中的液体，加750uWash Buffer（注意用加乙醇），10000rpm室温离心1min；
重复上述步骤一次；
不加Wash Buffer将管子10000rpm室温离心1min；
将柱状管放到一个消过毒的1.5m离心管中，加65ul灭菌水，室温放置2min，8000rpm室温离心3min 洗提（洗脱）DNA。
3. 质粒电泳
具体操作步骤（以倒20ml的胶为例）：
用50ml量筒量取20m1XTAE；
用电子天平称量0.16g琼脂糖，并倒入20ml电泳缓冲液中；
将称量纸覆盖在装有琼脂糖的电泳缓冲液的三角瓶中，放入微波炉中转1min30s，至肉眼看不到颗粒状琼脂为止；
至室温待溶液冷却至60度左右，将三角瓶中溶液倒入制胶盒中，并加入上样梳子；
至室温约30min胶凝固后，拔掉梳子并将凝胶安放到电泳槽内；
向电泳槽加入电泳缓冲液，刚好没过凝胶约1mm；
将样品中加入适量的10X上样缓冲液，该上样缓冲液的体积计算如下：如果样品体积是20ul加入2u10X上样缓冲液，如果是30ul，加入3u10X上样缓冲液；
将样品加入上样槽中，打开电源，一般为120v，电泳约20-30min，关掉电源，在Dark Reader荧光透射仪观察结果。
原创作者：上海岑特生物科技有限公司
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