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半定量RT-PCR的实验原理和方法步骤

上海古朵生物科技有限公司发布时间:2020/5/12 10:12:09

    RT-PCR将以RNA为模板的cDNA合成同PCR结合在一起,提供了一种分析基因表达的快速灵敏的方法。RT-PCR用于对表达信息进行检测或定量。另外,这项技术还可以用来检测基因表达差异或不必构建cDNA文库克隆cDNA。RT-PCR比其他包括Northern印迹、RNase保护分析、原位杂交及S1核酸酶分析在内的RNA分析技术,更灵敏,更易于操作。

    RT-PCR的模板可以为总RNA或poly(A)+选择性RNA。逆转录反应可以使用逆转录酶,以随机引物、oligo(dT)或基因特异性的引物(GSP)起始。RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。在两步法RT-PCR中,每一步都在最佳条件下进行。cDNA的合成首先在逆转录缓冲液中进行,然后取出1/10的反应产物进行PCR。在一步法RT-PCR中,逆转录和PCR在同时为逆转录和PCR优化的条件下,在一只管中顺次进行。

    实验步骤:
    Trizol法RNA提取步骤
    1、提取总RNA
    2、逆转录反应
    3、PCR反应

    以下实验步骤仅供参考:
    1 样品RNA的抽提
    ①取冻存已裂解的细胞,室温放置5分钟使其完全溶解。
    ②两相分离
    每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿,盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后,15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相,中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。
    ③RNA沉淀
    将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA,混匀后15到30℃孵育10分钟后,于4℃下12000rpm
    离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
    ④RNA清洗
    移去上清液,每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制),清洗RNA沉淀。混匀后,4℃下7000rpm离心5分钟。
    ⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液,使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。
    ⑥溶解RNA沉淀
    溶解RNA时,先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次,使其完全溶解,获得的RNA溶液保存于-80℃待用。


    2 RNA质量检测
    1)紫外吸收法测定
    先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释(1:100)后,读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值,测定RNA溶液
    浓度和纯度。
    ① 浓度测定
    A260下读值为1表示40 μg RNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为:A260 ×稀释倍数× 40
    μg/ml。具体计算如下:
    RNA溶于40 μl DEPC水中,取5ul,1:100稀释至495μl的TE中,测得A260=0.21
    RNA 浓度=0.21 ×100 ×40 μg/ml=840 μg/ml 或 0.84 μg/μl
    取5ul用来测量以后,剩余样品RNA为35 μl,剩余RNA总量为:
    35 μl × 0.84 μg/μl=29.4 μg
    ②纯度检测
    RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度,比值范围1.8到2.1。
    2)变性琼脂糖凝胶电泳测定
    ①制胶
    1g琼脂糖溶于72ml水中,冷却至60℃,10 ml的10× MOPS电泳缓冲液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3
    M)。
    10×MOPS电泳缓冲液
    浓度    成分
    0.4M    MOPS,pH 7.0
    0.1M    乙酸钠
    0.01M    EDTA
    灌制凝胶板,预留加样孔至少可以加入25
    μl溶液。胶凝后取下梳子,将凝胶板放入电泳槽内,加足量的1×MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。
    ②准备RNA样品
    取3μgRNA,加3倍体积的甲醛上样染液,加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10μg/ml。加热至70℃孵育15分钟使样品变性。
    ③电泳
    上样前凝胶须预电泳5min,随后将样品加入上样孔。5–6V/cm电压下2h,电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2–3cm。
    ④紫外透射光下观察并拍照
    28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓(其大小决定于用于抽提RNA的物种类型),上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带,它由低分子量的RNA(tRNA和5S核糖体RNA)组成。在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质,可能是由mRNA和其它异型RNA组成。RNA制备过程中如果出现DNA污染,将会在28S核糖体RNA带的上面出现,即更高分子量的弥散迁移物质或者带,RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。用数码照相机拍下电泳结果。

    3样品cDNA合成
    ①反应体系
    序号    反应物    剂量
    1    逆转录buffer    2μl
    2    上游引物    0.2μl
    3    下游引物    0.2μl
    4    dNTP    0.1μl
    5    逆转录酶MMLV    0.5μl
    6    DEPC水    5μl
    7    RNA模版    2μl
    8    总体积    10μl
    轻弹管底将溶液混合,6000rpm短暂离心。
    ②混合液在加入逆转录酶MMLV
    之前先70℃干浴3分钟,取出后立即冰水浴至管内外温度一致,然后加逆转录酶0.5μl,37℃水浴60分钟。
    ③取出后立即95℃干浴3分钟,得到逆转录终溶液即为cDNA溶液,保存于-80℃待用。


    4梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因(β-actin)实时定量PCR
    ①β-actin阳性模板的标准梯度制备
    阳性模板的浓度为1011,反应前取3μl按10倍稀释(加水27μl并充分混匀)为1010,依次稀释至109、108、107、106、105、104,以备用。
    ②反应体系如下:
    标准品反应体系
    序号    反应物    剂量
    1     SYBR Green 1 染料    10μl
    2    阳性模板上游引物F    0.5μl
    3    阳性模板下游引物R    0.5μl
    4    dNTP    0.5μl
    5    Taq酶    1μl
    6    阳性模板DNA    5μl
    7    ddH2O    32.5μl
    8    总体积    50μl
    轻弹管底将溶液混合,6000rpm短暂离心。
    管家基因反应体系:
    序号    反应物    剂量
  1    SYBR Green 1 染料    10μl
    2    内参照上游引物F    0.5μl
    3    内参照下游引物R    0.5μl
    4    dNTP    0.5μl
    5    Taq酶    1μl
    6    待测样品cDNA    5μl
    7    ddH2O    32.5μl
    8    总体积    50μl
    轻弹管底将溶液混合,6000rpm短暂离心。
    ③制备好的阳性标准品和检测样本同时上机,反应条件为:93℃ 2分钟,然后93℃ 1分钟,55℃ 2分钟,共40个循环。


    5 制备用于绘制梯度稀释标准曲线的DNA模板
    ①针对每一需要测量的基因,选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应。
    反应体系:
    序号    反应物    剂量
    1    10×PCR缓冲液    2.5 ul
    2    MgCl2溶液    1.5 ul
    3    上游引物F    0.5ul
    4    下游引物R    0.5ul
    5    dNTP混合液    3ul
    6    Taq聚合酶    1ul
    7    cDNA    1ul
    8    加水至总体积为    25ul
    轻弹管底将溶液混合,6000rpm短暂离心。
    35个PCR循环(94℃1分钟;55℃1分钟;72℃1分钟); 72oC延伸5分钟。
    ②PCR产物与 DNA Ladder在2%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色,检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。
    ③将PCR产物进行10倍梯度稀释: 将PCR产物进行10倍梯度稀释:
    设定PCR产物浓度为1×1010,依次稀释至109、108、107、106、105、104几个浓度梯度。


    6 待测样品的待测基因实时定量PCR
    ①所有cDNA样品分别配置实时定量 PCR反应体系。
    体系配置如下:序号    反应物    剂量
    1    SYBR Green 1 染料  10 ul
    2    上游引物    1ul
    3    下游引物    1ul
    4    dNTP   1ul
    5    Taq聚合酶    2ul
    6    待测样品cDNA    5ul
    7    ddH2O   30ul
    8    总体积    50ul
    轻弹管底将溶液混合,6000rpm短暂离心。
    ②将配制好的PCR反应溶液置于Realtime PCR仪上进行PCR扩增反应。反应条件为:93℃2分钟预变性,然后按93℃
    1分钟,55℃1分钟,72℃1分钟,共40做个循环,最后72℃7分钟延伸。7 实时定量PCR使用引物列表
    引物设计软件:Primer Premier
    5.0,并遵循以下原则:引物与模板的序列紧密互补;引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构;引物不在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。

阅读人数:67 原创作者:上海古朵生物科技有限公司

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