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如何铺出漂亮、均匀的细胞板?

点击次数:418   发布时间:2020/6/2 15:28:51

做贴壁细胞的实验,经常需要做细胞铺板。这个实验看似简单,其实也不是那么好做的。关键是要铺得均匀铺得平整,要是中间密周围稀,或者周围密中间秃顶,那就露怯啦。

如下图,为细胞铺板时,常出现的细胞分布不均匀现象。

细胞居中和细胞边缘化

从经济和高效的角度来说,需要根据实验目的选择不同规格的培养板。如在进行药物对待测细胞半抑制率(IC50)测试时,通常使用96孔板,一方面可以设置浓度梯度;另外还可一次性测多个药物,减少实验误差。

收集细胞要混匀

消化后的细胞一定要充分混匀,要把聚在一起的细胞团充分地吹打开,是单个的状态,但同时又不能损伤细胞,可以用玻璃吸管的移液器操作。离心也很有讲究,一般用1000 rpm/min即可。离心力太大细胞容易抱团!然后悬浮离心后的细胞团时,先不要把所有液体都加进去!一般先加2mL液体,然后用1mL移液器轻轻将细胞吹起,细胞要像云雾一样散开,这样易于形成单细胞。象下图所示的这种移液器就非常好用。

接种细胞须小心

铺6孔板,12孔板或24孔板,先在每个孔里面加1mL的培养基,晃动使之铺匀整个孔底,然后加入1 mL的细胞悬液。从孔的左边靠近底部慢慢加入,这样细胞悬液会平铺在整个孔底,细胞分散较均匀,注意加完细胞悬液后要放工作台静置一下。这里又有一个窍门,放在显微镜的载物台上面。因为显微镜的载物台是水平校正过的,比什么桌面、超净台什么的要平多了。在载物台上放置20-30分钟,细胞不差这一会温度和二氧化碳的,等细胞贴壁了,轻轻移入到孵箱中。

铺96孔板,我每孔是加100微升细胞悬液,加完半边板48孔后,将剩下的未加的细胞悬液再混一下,再继续加剩余的半边板子,都加完后盖上盖子,左手轻轻扶住板的左边,右手轻轻敲击板的右边缘,注意把握力度,敲三次即可,太大力或次数太多会导致细胞集中成堆。也有人推荐轻微的左三圈、右三圈、前三圈、后三圈。

轻轻敲打勿抱团

细胞悬液加完后,将细胞培养板抬高,对着灯光,从底部往上看,看细胞有没有抱团。如果有抱团的话,用手指从底部轻轻敲打,使之分散。也可以用平板振荡器稍稍振荡一下,效果不错。参数要设置成振幅小而频率高哈。

十字交叉要水平

观察和敲打后放入培养箱,然后画“十字”,就是把细胞培养板贴着培养箱搁板,前后方向来回晃动10次,再左右方向晃动10次,正好是一个“十” 字形。然后就让它静静地呆在培养箱搁板上,没事不要去动它。这里要注意的是,托架应该装在四根立柱相同高度的孔上,培养箱的搁板要水平校正,尽量地做到水平。搁板会向一个方向倾斜,对于贴壁时间长的细胞,就算当时混匀了,放进培养箱后也摇匀了,但是重力作用下细胞也会向一侧聚集。 培养箱里面或者外面尽量不要放可以产生振动的仪器,比如蠕动泵、离心机、涡旋器一类的仪器。这些仪器产生的振动对细胞贴壁有影响,也可能会导致细胞贴壁不均匀。还是要给细胞一个安安静静的生长环境,让他安静地做个美男子好了。

原创作者:上海岑特生物科技有限公司

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