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RNA测序,真的有那么准确吗?

点击次数:408   发布时间:2020/7/3 9:58:33

RNA测序是遗传学家工具箱中的一种常用工具。利用RNA测序,研究人员能够定量地检测各种生物体的基因表达,从而更好地了解细胞中正在发生的事情以及特定基因的功能。由于在药物发现、疾病诊断和基因鉴定中具有潜在作用,RNA测序的应用似乎无极限。

RNA测序的准确性

早在2014年,《Nature Biotechnology》上发表了三篇文章。它们属于RNA测序质量控制(SEQC)项目的一部分,旨在评估新一代测序平台的性能以及RNA分析的优势和局限。研究人员测试了三个常用RNA测序平台的可靠性、准确性和信息内容,希望确定平台的使用范围并寻找变化的来源。

在整个研究过程中,三个研究机构都产生了超过10亿个核苷酸的数据。他们还研究了30个不同的RNA测序实验室所使用的技术以及数百名研究人员使用的生化方法。总的来说,他们认为RNA的提取和分析可以跨机构圆满完成,即使样本已严重降解,但是遗传数据仍然可靠。

这些结果让研究机构以及医生患者放心,RNA测序是准确且可靠的。一项研究的负责人、梅奥诊所的E. Aubrey Thompson评论道:“患者的护理决策似乎受到基因组数据的影响,而这些数据来源于患者样本的RNA和DNA测序。如今我们知道了这些分析可在多大程度上依赖某个实验室。”

 

生物实验的重复性危机

如今,我们正处于所谓的重复性危机中,越来越多的研究变得难以重复,甚至不可能重复。据估计,单单就美国而言,每年花在无法重复的生物研究上的费用高达280亿美元。除了经济成本之外,不可重复的研究还造成药物开发的延误,阻碍疾病疗法的开发。

在设计实验和决定使用哪种技术时,重复性仍然是人们主要考虑的因素。可靠的方法通常是许多人的首-选,比如RNA测序。然而,以色列特拉维夫大学的研究人员开展的荟萃分析表明,RNA测序的数据分析过程中存在技术偏倚,可能造成数据的错误解释和大量错误结果1。

RNA测序无法重复?

在分析了35个公开的RNA测序数据集之后,研究人员注意到某些基因反复呈现基因表达的变化。这些数据来自近年发表的人类和小鼠研究,覆盖了多个生物过程。他们对此感到困惑,想了解这一现象背后究竟是真实的生物学现象,还是实验过程引入的人为误差。

在其中30个数据集中,研究人员发现特别长或特别短的基因往往表现出*-明显的基因表达水平变化。大多数短基因编码了组成核糖体的蛋白质,而许多长基因则编码了与细胞外基质有关的蛋白质。

经过进一步的研究,他们发现这种现象源于实验的人为因素,而不是天然的生物反应。在比较相同条件下的重复样本后,他们发现这种模式是由于技术偏倚,似乎与基因的长度有关。此外,若统计分析中存在缺陷,人们往往将检测到的偏倚错误地标为细胞反应,特别是与核糖体或细胞外基质有关的反应。在许多常用的数据归一化方法中,这种偏倚并未得到校正,因此可能已包含在许多数据集中。

这种效应被称为样本特异性长度效应(sample-specific length effect),之前已在文献中提到过。许多研究人员已经意识到这一问题,但没有积极地解决它。在此次分析的数据集中,未经校正的数据比例仍然很高。

不要低估统计分析的重要性

尽管乍一看让人担忧,但结果似乎也不是那么严重。在文中,研究人员还介绍了如何克服和消除这种偏倚,从而过滤掉错误的结果,保持生物学上的相关性。将基因长度视为样本特异性的协变量,可以明显减少假阳性结果的数量。

目前还不清楚哪些因素能够淡化样本特异性的长度效应,可能还需要进一步研究。作者建议研究人员在自己的研究中注意这种偏倚,并将建议的数据归一化方法作为默认步骤,应用在RNA-seq数据分析的标准实践中。

美国北卡罗来纳大学教堂山分校的生物统计学家Michael Love表示:“这篇文章很好地证明了质量控制的重要性。”他指出,还有一些偏倚也会影响RNA测序数据的质量,比如GC含量偏倚,各个研究团队在分析过程中应始终考虑这些因素。他本人并未参与此项研究。

这项研究强调称,所有技术都不是100%可靠的,因为偏倚的可能性始终存在。随着各个研究领域的重复性危机浮出水面并获得关注,这项工作强化了准确开展统计分析的必要性。

原创作者:上海岑特生物科技有限公司

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