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免疫组化方法中关键环节及其原理解述

上海古朵生物科技有限公司发布时间:2020/7/29 10:47:23

一、酶免疫组化的关键环节

1、标本固定:固定的目的是①防止标本从玻片上脱落;②除去防碍抗原-抗体结合的类脂,使抗原抗体结合物易于获得良好的染色结果;③固定的标本易于保存。

2、脱水、石蜡包埋和制片:脱水用梯度乙醇(由低到高)充分脱水、对组织要完全浸蜡、切片时刀片要干净和锋利。否则,容易裂片和脱片等。

3、脱蜡和水化:这是为了后面的抗体等试剂能够充分与组织中抗原等结合反应。脱蜡可以先60度20min,然后立即二甲苯1-3分别10min,但当天制好的切片可以60度3-4h。水化用梯度乙醇(由高到低)。若脱蜡和水化不全易出现局灶性反应和浸洗不全,而产生非特异性背景着色。

4、抗原修复:由于组织中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定过程中,发生了蛋白之间交联及醛基的封闭作用,从而失去抗原性;通过抗原修复,使得细胞内抗原决定族重新暴露,提高抗原检测率。常用的修复方法从强到弱一般分为三种,高压修复、微波修复、胰酶修复。修复液也分为若干种(具体的可以查阅相关资料,大量的:中性的、高pH的等)。我们实验室一般用微波修复中火6min*4次,效果不错。注意微波修复后自然冷却30min左右(只要你觉得修复液的温度达室温即可)。

5、细胞通透:目的是使抗体能够充分地进入胞内进行结合反应。一般用Triton X-100、蛋白酶k等通透液。如Triton X-100可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大分子结构的物质进入胞浆和胞核内,故在细胞免疫组化时尤为推荐使用,这样抗体就能顺利进入胞内与相应抗原结合。在免疫组织化学(>10um厚切片) 和免疫细胞化学中一般用Triton X-100 作为细胞通透剂,在膜上打孔。

6、灭活内源性过氧化物酶和生物素:在传统的ABC法和SP法中,免疫组化反应结果容易收到内源性过氧化物酶和生物素的干扰,必须用过氧化氢和卵白素等进行灭活。灭活内源性POD一般3%过氧化氢灭活时间短点,可以10min左右,而0。3%过氧化氢则可以适当延长封闭时间,一般10~30min;用甲醇配置过氧化氢比双蒸水或PBS可能好在保护抗原和固定组织作用,过氧化氢孵育时间过长易引起脱片;现用现配,配好后4度避光保存。不过,现在已有“第二代即用型免疫组化试剂盒”避免内源性生物素的干扰,推荐使用。

7、血清封闭:组织切片上有剩余的位点可以与一抗非特异性结合,造成后续结果的假阳性;封闭血清一般是和二抗同一来源的,血清中动物自身的抗体,预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合;也可以用小牛血清、BSA、羊血清等,但不能与一抗来源一致。一般室温或37度10-30min。

8、一抗和二抗浓度和孵育时间:一抗孵育条件在免疫组化反应中最重要,包括孵育时间和抗体浓度。一抗孵育温度有几种:4度、室温、37度,其中4度效果最-佳;孵育时间:这与温度、抗体浓度有关,一般37度1-2h,而4度过夜和从冰箱拿出后37度复温45min。具体条件还要摸索。二抗孵育条件:二抗一般室温或37度30min-1h,具体时间需要摸索,而浓度一般有工作液,若是浓缩液还要摸索浓度。但在免疫组化中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下,然后去摸索一抗浓度和孵育时间。

9、抗体稀释液:其实许多实验室抗体稀释液就用一般PBS即可,但专用的抗体稀释液中除PBS成份外,还加了叠氮-化钠防腐剂、BSA稳定剂等组份,对抗体的多次回收利用较好。正因为这种原因,我一直用国产的专用抗体稀释液,一段时间在geng换新抗体稀释液时实验结果出现了阴性结果(提示可能一抗没有结合),最后从抗体浓度和孵育时间、封闭时间等原因排除后,发现是新抗体稀释液的PH值偏酸,而使抗原抗体反应不佳,终而出现假阴性结果。

10、切片清洗(浸洗、冲洗和漂洗):为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起非特异性染色,所以适当地加强清洗(延长时间和增多次数)尤为重要,我一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次,而一抗孵育后的清洗均为5次*5min。

注意:(1)单独冲洗,防止交叉反应造成污染。(2)温柔冲洗,防止切片的脱落。我喜欢用浸洗方式;(3)冲洗的时间要足够,才能彻底洗去结合的物质。(4)PBS的PH和离子强度的使用和要求。这方面我有惨痛教训,当时我买的抗体稀释液偏酸,结果背景一片黄(未见特异性染色),建议PH在7.4-7.6浓度是0.01M。(中性及弱硷性条件(PH7-8)有利于免疫复合物的形成,而酸性条件则有利于分解;低离子强度有利于免疫复合物的形成,而高离子强度则有利于分解)

11、DAB显色:背景的深浅和特异性染色的深浅均可以由DAB孵育条件决定。DAB显色时间不是固定的,主要由显微镜下控制显色时间,到出现特异性染色较强而本底着色较浅时即可冲洗;DAB显色时间很短(如几秒或几十秒)就出现很深的棕褐色,这很可能说明你的抗体浓度过高或抗体孵育时间过长,需要下调抗体浓度或缩短你的抗体孵育时间;此外,若很短时间就出现背景很深,还有可能你前面的封闭非特异性蛋白不全,需要延长封闭时间;DAB显色时间很长(如超过十几分钟)才出现阳性染色,一方面可能说明你的抗体浓度过低或孵育时间过短(最-好一抗4度过夜);另一方面就是封闭时间过长。

12、复染:目的是形成细胞轮廓,从而geng好地对目标蛋白进行定位,经常用苏木素复染(胞核染料)。注意苏木素复染时间要看当时的室温、溶液的新旧、目标抗原的定位等情况,一般数秒-数分钟,胞浆蛋白可以适当时间长一点,而胞核蛋白则要短。不过这个如果染色不理想可以补救的。即:染色深则分化时间稍长些即可;染色浅则再置于苏木素中染色即可。

盐酸酒精是分化,氨水是返兰。作用不同。片子复染完后流水振洗,然后置于盐酸酒精中数秒(一定动作要快)后拿出流水振洗,在放入氨水中返兰即可。

13、封片:为了长期保存,我们一般用中性树胶等封片,避免产生气泡,方法是直接在载玻片组织上滴一滴封片液,然后一手拿住盖片某一拐角,而另一手拿对面的那个拐角,接近封片液近端的拐角先降低,直至接触到液体时为止;当发现液体接触面在不断弥散时,则可以缓慢降低另一拐角,这样一般不会产生气泡。

二、免疫荧光方法中的重要环节

1、冰冻切片制备:建议用新鲜组织,否则组织细胞内部结构破坏,易使抗原弥散。选用干净锋利的刀片、组织一定要冷冻适度等,防止裂片和脱片严重。

2、组织切片固定:切好片风干后立即用冰丙酮等固定液进行固定5-10min,尤其要较长时间保存的白片,一定要及时固定和适当保存。

3、血清封闭:为防止内源性非特异性蛋白抗原的结合,需要在一抗孵育前先用血清(与二抗来源一致)封闭,减弱背景着色。血清封闭的时间是可以调整的,一般10-30min。

4、一抗孵育条件:在免疫组化反应中最重要,包括孵育时间和抗体浓度。一抗孵育温度有几种:4度、室温、37度,其中4度效果最-佳;孵育时间:这与温度、抗体浓度有关,一般37度1-2h,而4度过夜和从冰箱拿出后37度复温45min。具体条件还要摸索。

5、二抗孵育条件:二抗一般室温或37度30min-1h,具体时间需要摸索,而浓度一般有工作液,若是浓缩液还要摸索浓度,切记要避光反应。但在免疫荧光中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下,然后去摸索一抗浓度和孵育时间。最后,荧光素标记的二抗随着保存时间的延长,可能后有大量的游离荧光素残留,需要注意配制时小包装和并进行适当的离心。

6、复染:目的是形成细胞轮廓,从而geng好地对目标蛋白进行定位。一般常用DAPI复染。

7、封片:为了长期保存,我们一般用缓冲甘油等封片,此外还有专门的抗荧光萃灭封片液。避免产生气泡,方法是直接在载玻片组织上滴一滴封片液,然后一手拿住盖片某一拐角,而另一手拿对面的那个拐角,接近封片液近端的拐角先降低,直至接触到液体时为止;当发现液体接触面在不断弥散时,则可以缓慢降低另一拐角,这样一般不会产生气泡。

8、切片清洗:为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起非特异性染色,所以适当地加强清洗(延长时间和增多次数)尤为重要,我一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次,而一抗孵育后的清洗均为5次*5min。注意

(1)单独冲洗,防止交叉反应造成污染。

(2)温柔冲洗,防止切片的脱落。我喜欢用浸洗方式;

(3)冲洗的时间要足够,才能彻底洗去结合的物质。

(4)PBS的PH和离子强度的使用和要求。这方面我有惨痛教训,当时我买的抗体稀释液偏酸,结果背景一片黄(未见特异性染色),建议PH在7.4-7.6浓度是0.01M。(中性及弱硷性条件(PH7-8)有利于免疫复合物的形成,而酸性条件则有利于分解;低离子强度有利于免疫复合物的形成,而高离子强度则有利于分解)

9、拍照:有条件的话最-好立即拍照,若不能及时拍照,也要封好片和用指甲油封固,保持避光和湿度。使用荧光显微镜注意严格按照荧光显微镜出厂说明书要求进行操作,不要随意改变程序;应在暗室中进行检查;防止紫外线对眼睛的损害,在调整光源时应戴上防护眼镜;检查时间每次以1~2h为宜,超过90min,超高压汞灯发光强度逐渐下降,荧光减弱;标本受紫外线照射3~5min后,荧光也明显减弱或褪色;激发光长时间的照射,会发生荧光的衰减和淬灭现象;所以最多不得超过2~3h;荧光显微镜光源寿命有限,标本应集中检查,以节省时间,保护光源。天热时,应加电扇散热降温,新换灯泡应从开始就记录使用时间。

灯熄灭后欲再启用时,须待灯光充分冷却后才能点燃。一天中应避免数次点燃光源。关闭汞灯至少在开启15-30分钟后;标本染色后立即观察,因时间久了荧光会逐渐减弱。若将标本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存,可延缓荧光减弱时间,防止封裱剂蒸发;使用的玻片等载体,都必须厚度均匀,无明显的自发荧光,如果使用油镜,还必须保证镜油为无荧光镜油;电源最-好装稳压器,否则电压不稳不仅会降低汞灯的寿命,也会影响镜检的效果。

阅读人数:33 原创作者:上海古朵生物科技有限公司

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