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如何快速破译质粒图谱?必看!

上海古朵生物科技有限公司发布时间:2020/9/9 11:11:01

质粒是基因工程中常用的载体,也是生物学实验的基本要素,正确的阅读质粒图谱是实验的步,对于实验小白,本文教你如何快速破译质粒图谱。

首先,熟悉你所感兴趣的质粒

让我们从一个经典的质粒pBR322开始,由于它具有成功克隆所需要的所有特性,因此常被用作衍生载体的主干。从图谱中心可以看到,线性化质粒的大小为4361个碱基对。在开始处理任何质粒之前,建议使用一种独特的限制性内切酶将其线性化,以检查大小是否与预期大致相同。

黑色箭头表示转录的方向,这是克隆所必需的。如果你在另一个基因的中间克隆了你的目的基因,请确保这两个基因的转录方向相同。否则,本地启动子会干扰你的基因表达。

“Ori”是什么意思?

在诸如Entrez-PubMed这样的基因序列数据库中,质粒序列以线性序列的形式从ori序列开始绘制。“Ori”指质粒复制的起点,不能改变它,一旦质粒不能复制,则是无用的。

关于ori要记住的另一件事是,同源质粒常常是不相容的。这意味着你将无法在一个细胞中维持两个pBR323衍生的载体,即使它们具有不同的抗生素耐药性基因。pBR322 ori也被用于pUC18,真核生物载体中第二常见的主干。

限制性位点在哪里找?

相应酶的限制性位点用起始核苷酸位置的垂直线表示。这些位置应该是唯1的,但值得一查,因为衍生载体通常包含额外的被遗忘的序列。

关于抗生素抗性基因

pBR322有两种抗性基因:tet(四环素耐药)和amp(氨苄青霉素耐药)。这些基因分别编码一个外排泵(tetR)和β-内酰胺酶(ampR)从细胞中排泄四环素和氨苄青霉素。Tet和amp从不同的方向阅读。

记住,β-内酰胺酶对青霉素类抗生素的解毒没有特异性。所以即使你有两个不同复制起点的质粒,如果一个表达了甲氧西林耐药基因另一个表达了氨苄青霉素抗性基因,你也不能同时选择两个质粒。

当使用限制性内切酶位点将目的基因克隆到质粒时,要注意哪些位点属于你的抗生素抗性基因。例如,BamHI在TetR的中间酶切。我们都知道,基因的破坏会导致基因功能的失活——在这种情况下,就是抗生素耐药性。

复制如何开始和停止?

质粒除了基因外,通常还包含转录启动子和终止子来自E.coli噬菌体。噬菌体SP6和T7的启动子常用于体外RNA扩增。它们需要噬菌体聚合酶,因此在体内不活跃。

下图为爪蟾卵母细胞表达载体pTLNX的表达图谱。除了常见的pBR322?ori和抗生素耐药基因AmpR和CmR(氯霉素耐药)外,还存在SP6和lacUV启动子。在SP6启动子下游,rrnBT2终止子允许克隆到多克隆位点的基因有效终止。


pTLNX载体还具有质粒选择基因(ccdB),以及病毒SV40核定位信号和Xenopus globine 3 ' UTR,允许克隆基因的高表达。

质粒图谱总是在进化,使用已知的图谱资源库,如Addgene、Entrez-PubMed等,以免忽略一些“不重要”的特性,而这些特性对您的实验可能是至关重要

阅读人数:56 原创作者:上海古朵生物科技有限公司

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