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实验室常用质粒载体的构建思路

上海古朵生物科技有限公司发布时间:2020/9/10 10:38:31

DNA载体可使目的基因在细胞内表达以达到我们的研究目的。

人工改造的 质粒是最常用的载体之一,通常具有以下几个特点:

1. 有一个或多个限制性内切酶的切点,便于目的基因插入;

2. 带有标记基因(抗性基因、荧光基因等),便于筛选;

3. 大小合适(一般小于10kb),便于转染。

载体质粒示例:

MCS(multiple cloning site):多克隆位点外源基因插入;

CMV启动子(以及SV40、bla、T7、U6……):高效率启动基因表达;

SV40 polyA信号(以及TK polyA……):转录终止,给mRNA添加polyA尾防降解;

neomycin/kanamycin resistance ORF 新霉素(G418) /卡那霉素抗性 (以及Ampicillin氨苄、puromycin嘌呤霉素……):用于细菌转化/细胞转染后的筛选。
选择限制性内切酶构建载体应注意:

1. 单酶切后载体容易自连必须去磷酸化, 不能保证插入片段的方向;

2. 双酶切需要注意同尾酶的自连。

表达基因扩增的 引物设计:

1. NCBI Gene 数据库查找基因cDNA序列;

2. 查找CDS区序列的酶切位点,对比载体上的酶切位点,避免冲突

3. CDS区首、尾序列+ 5’端加上酶切位点和(或) 保护碱基

表达载体构建 简要流程

1. PCR扩增出基因CDS区,1400bp左右,胶回收;

2. 双酶切胶回收产物及载体,胶回收;

3. 酶切后的产物用T4连接酶(Takara) 连接过夜,转化,鉴定。

常见问题

1. 引物特异性不好,PCR杂带太多或根本扩增不出来

在CDS区的上下游重新选择引物,扩增成功后,以这个大一点的片段为模板扩增CDS区;

人基因ORF库购买。

2. PCR产物酶切不成功

构建克隆载体,再酶切;

载体自连会使Lac Z编码,在IPTG/X-Gal平板上呈现蓝色。

3. 没有合适的酶切位点

无缝克隆试剂盒。

4. 没有合适的抗体

加上标签,翻译成融合蛋白,比如His、HA、Flag、Myc等,N端C端均可;

引物设计:CDS区序列,5’端依次加上标签序列、酶切位点和(或)保护碱基;

载体自带标签,需要注意酶切位点处可能移码。

点突变质粒

1. 使用高保真酶进行定点突变:PrimeSTAR Max DNA polymerase

PCR合成突变质粒,DpnI消化模板质粒,转化培养,后续测序鉴定。

2. 使用无缝克隆连接进行定点突变:

PCR扩增出突变的线性化载体,无缝克隆连接成环状质粒,转化培养,后续测序鉴定。

原理提要

1. 切割区的选择在于PAM序列-NGG;

2. 特异性在于sgRNA的20个碱基;

3. Cas9失活:D10A、H840A突变。

sgRNA设计

1. NGG序列前面,长度20nt左右;

2. GC含量在40-60%之间;

3. 尽量以G碱基开始,最后7个碱基的靶向性要好;

4. 尽量靠近基因编码区的ATG下游,或第二外显子。

CRISPR/Cas9质粒的构建

1. 线性化载体;

2. sgRNA双链结合;

3. sgRNA与载体连接;

4. 菌P鉴定。

基因敲除效果鉴定

1.Western检测蛋白表达量;

2.双sgRNA敲除,间隔200-500bp左右。鉴定引物设计在两个gRNA外侧。

阅读人数:66 原创作者:上海古朵生物科技有限公司

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