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实验室常用质粒载体的构建思路
点击次数：512 发布时间：2020/9/10 10:38:31
DNA载体可使目的基因在细胞内表达以达到我们的研究目的。
人工改造的 质粒是*常用的载体，通常具有以下几个特点：
1. 有一个或多个限制性内切酶的切点，便于目的基因插入；
2. 带有标记基因（抗性基因、荧光基因等），便于筛选；
3. 大小合适（一般小于10kb），便于转染。
载体质粒示例：
MCS（multiple cloning site）：多克隆位点外源基因插入；
CMV启动子（以及SV40、bla、T7、U6……）：高效率启动基因表达；
SV40 polyA信号（以及TK polyA……)：转录终止，给mRNA添加polyA尾防降解；
neomycin/kanamycin resistance ORF 新霉素(G418) /卡那霉素抗性 (以及Ampicillin氨苄、puromycin嘌呤霉素……）：用于细菌转化/细胞转染后的筛选。
选择限制性内切酶构建载体应注意：
1. 单酶切后载体容易自连必须去磷酸化， 不能保证插入片段的方向；
2. 双酶切需要注意同尾酶的自连。
表达基因扩增的 引物设计：
1. NCBI Gene 数据库查找基因cDNA序列；
2. 查找CDS区序列的酶切位点，对比载体上的酶切位点，避免冲突
3. CDS区首、尾序列+ 5’端加上酶切位点和（或） 保护碱基
表达载体构建 简要流程
1. PCR扩增出基因CDS区，1400bp左右，胶回收；
2. 双酶切胶回收产物及载体，胶回收；
3. 酶切后的产物用T4连接酶(Takara) 连接过夜，转化，鉴定。
常见问题
1. 引物特异性不好，PCR杂带太多或根本扩增不出来
在CDS区的上下游重新选择引物，扩增成功后，以这个大一点的片段为模板扩增CDS区；
人基因ORF库购买。
2. PCR产物酶切不成功
构建克隆载体，再酶切；
载体自连会使Lac Z编码，在IPTG/X-Gal平板上呈现蓝色。
3. 没有合适的酶切位点
无缝克隆试剂盒。
4. 没有合适的抗体
加上标签，翻译成融合蛋白，比如His、HA、Flag、Myc等，N端C端均可；
引物设计：CDS区序列，5’端依次加上标签序列、酶切位点和（或）保护碱基；
载体自带标签，需要注意酶切位点处可能移码。
点突变质粒
1. 使用高保真酶进行定点突变：PrimeSTAR Max DNA polymerase
PCR合成突变质粒，DpnI消化模板质粒，转化培养，后续测序鉴定。
2. 使用无缝克隆连接进行定点突变：
PCR扩增出突变的线性化载体，无缝克隆连接成环状质粒，转化培养，后续测序鉴定。
原理提要
1. 切割区的选择在于PAM序列-NGG；
2. 特异性在于sgRNA的20个碱基；
3. Cas9失活：D10A、H840A突变。
sgRNA设计
1. NGG序列前面，长度20nt左右；
2. GC含量在40-60%之间；
3. 尽量以G碱基开始，*后7个碱基的靶向性要好；
4. 尽量靠近基因编码区的ATG下游，或第二外显子。
CRISPR/Cas9质粒的构建
1. 线性化载体；
2. sgRNA双链结合；
3. sgRNA与载体连接；
4. 菌P鉴定。
基因敲除效果鉴定
1.Western检测蛋白表达量；
2.双sgRNA敲除，间隔200-500bp左右。鉴定引物设计在两个gRNA外侧。
人工改造的 质粒是*常用的载体，通常具有以下几个特点：
1. 有一个或多个限制性内切酶的切点，便于目的基因插入；
2. 带有标记基因（抗性基因、荧光基因等），便于筛选；
3. 大小合适（一般小于10kb），便于转染。
载体质粒示例：
MCS（multiple cloning site）：多克隆位点外源基因插入；
CMV启动子（以及SV40、bla、T7、U6……）：高效率启动基因表达；
SV40 polyA信号（以及TK polyA……)：转录终止，给mRNA添加polyA尾防降解；
neomycin/kanamycin resistance ORF 新霉素(G418) /卡那霉素抗性 (以及Ampicillin氨苄、puromycin嘌呤霉素……）：用于细菌转化/细胞转染后的筛选。
1. 单酶切后载体容易自连必须去磷酸化， 不能保证插入片段的方向；
2. 双酶切需要注意同尾酶的自连。
表达基因扩增的 引物设计：
1. NCBI Gene 数据库查找基因cDNA序列；
2. 查找CDS区序列的酶切位点，对比载体上的酶切位点，避免冲突
3. CDS区首、尾序列+ 5’端加上酶切位点和（或） 保护碱基
表达载体构建 简要流程
1. PCR扩增出基因CDS区，1400bp左右，胶回收；
2. 双酶切胶回收产物及载体，胶回收；
3. 酶切后的产物用T4连接酶(Takara) 连接过夜，转化，鉴定。
常见问题
1. 引物特异性不好，PCR杂带太多或根本扩增不出来
在CDS区的上下游重新选择引物，扩增成功后，以这个大一点的片段为模板扩增CDS区；
人基因ORF库购买。
2. PCR产物酶切不成功
构建克隆载体，再酶切；
载体自连会使Lac Z编码，在IPTG/X-Gal平板上呈现蓝色。
3. 没有合适的酶切位点
无缝克隆试剂盒。
4. 没有合适的抗体
加上标签，翻译成融合蛋白，比如His、HA、Flag、Myc等，N端C端均可；
引物设计：CDS区序列，5’端依次加上标签序列、酶切位点和（或）保护碱基；
载体自带标签，需要注意酶切位点处可能移码。
点突变质粒
1. 使用高保真酶进行定点突变：PrimeSTAR Max DNA polymerase
PCR合成突变质粒，DpnI消化模板质粒，转化培养，后续测序鉴定。
2. 使用无缝克隆连接进行定点突变：
PCR扩增出突变的线性化载体，无缝克隆连接成环状质粒，转化培养，后续测序鉴定。
原理提要
1. 切割区的选择在于PAM序列-NGG；
2. 特异性在于sgRNA的20个碱基；
3. Cas9失活：D10A、H840A突变。
sgRNA设计
1. NGG序列前面，长度20nt左右；
2. GC含量在40-60%之间；
3. 尽量以G碱基开始，*后7个碱基的靶向性要好；
4. 尽量靠近基因编码区的ATG下游，或第二外显子。
CRISPR/Cas9质粒的构建
1. 线性化载体；
2. sgRNA双链结合；
3. sgRNA与载体连接；
4. 菌P鉴定。
基因敲除效果鉴定
1.Western检测蛋白表达量；
2.双sgRNA敲除，间隔200-500bp左右。鉴定引物设计在两个gRNA外侧。
原创作者：上海岑特生物科技有限公司
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