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慢病毒滴度测定全攻略！
点击次数：625 发布时间：2020/11/20 9:47:00
从上世纪90年代以来，借助病毒感染真核细胞，成为了实验中转移遗传物质的重要手段。其中，由于慢病毒能感染的细胞类型广泛（包括分裂与不分裂细胞，干细胞等），可携带不低于5 kb的外源基因，并具有稳定插入宿主基因组等优势，成为目前主流的工具病毒。在一些特定的实验中，我们需要为病毒的浓度，即滴度，进行测定。本文将为大家介绍常用的两种滴度测定方法。
一、取舍的问题
在正式做实验之前，不妨先问自己这个问题：到底需不需要准确地测定慢病毒的滴度？
网上一搜，可以找到许多滴度测定的方案，也有不少商品化的试剂盒。这些方案各有优劣，但基本上都有这样一个规律：越准确，就越花时间。越省事的，就越不准确。但是，准确度对我们的实验来说，到底有多重要呢？
这个问题的答案，其实是跟我们使用病毒的实验目的密切相关的。如果这批慢病毒是用来建立稳定过表达编码基因或者shRNA等细胞系的，我觉得，根本没有必要对病毒的滴度进行细致地测定。至少我本人在这类情况下，是不测其准确滴度的。由于建立稳定细胞系，需要用抗生素筛选或者流式分选的方法，将阳性细胞挑出来，因此，即使感染效率没有达到100%，也并不要紧。
如果你是包装和使用慢病毒的新手，本司机建议在收了粗病毒上清后，分别在3个10-cm贴壁培养体系（或等同的悬浮培养体系）中，加入0.5、1、2 ml的病毒进行感染。*后，这其中总有一到两个皿满足使用，也比完整地走一套准确测定流程要省事许多。等熟练之后，大致摸清楚了自己的实验技术，以及外源基因长度和病毒活性滴度之间的关系，就不用设3个感染梯度做实验了。比如像基于pLKO表达shRNA这种很短的病毒基因组，在一个10-cm皿中我只加100-200 ?l。而如果是表达好几个kb的ORF，或者整个慢病毒质粒很大，我可能会加1 ml甚至更多。
二、快速测定法
当滴度准确性并不重要时，我们可以选择一些快速测定方案。不过，目前网上主流的实验技术指导文章，围绕这部分的内容都已相对陈旧。这其中包括PCR法测定病毒核酸量，ELISA法测定病毒外壳蛋白量。虽然相比我后面要讲的方法要快上得多，但这些实验一整套做下来，依然需要花费几个小时。
我目前使用的快速测定法，是用Clontech的Lenti-X GoStix试纸。它本质上也是测定病毒p24外壳蛋白量的方法，但相比传统的ELISA法来说，可要方便不少。当然，*后得到的结果，也不如ELISA法来得准确。只不过这种不准确性，是可以接受的。
具体的实验步骤是，在收获病毒之前，取20 ?l 293T细胞培养上清滴到试纸上，再滴加3-4滴Chase buffer，后静置5-10 min，等试剂均匀在试纸上展开后显色即可。只要在T那里有条带显示，就证明慢病毒粗上清达到可用滴度。
三、准确测定法
目前，所有的快速测定法都是不准确的，因为它们都没有考虑慢病毒的活性。也就是说，死病毒也会一并被测出来。在一些比较严格实验中，比如用慢病毒做RNAi-screening或CRISPR-screening，由于需要严格控制MOI，就需要测定慢病毒的准确滴度。
1、荧光报告基因法
对于携带荧光报告基因的慢病毒来说，测定起来可要简单得多。大致的实验流程是：
在6孔板中，均匀地种入1~3×10^5个细胞。可不等细胞贴壁，直接加入0、5、10、15、20、30 ?l粗病毒。若是纯化、浓缩的病毒，则按照浓缩比例，取一点点按比例重新回去，再按上述体积加入细胞中。可加入终浓度为2-10 ?g/ml的Polybrene。每孔培养基+细胞悬液+病毒+Polybrene的总体积为1.5-2 ml。
细胞贴壁，换液。
第三或第四天，用流式细胞术，或者荧光显微镜（可用Hoechst 33342染总细胞），计算各剂量组带荧光的细胞比例，就可以换算出原始的平均病毒滴度。如果天加入的病毒是稀释过的，记得将算出来的数值再乘一下稀释倍数。具体的公式就不用啰嗦了吧，小学初中的数学题而已。
值得注意的是，当病毒滴度较高时，很容易在高剂量组中达到100%阳性。这样的数据是不可以参与平均滴度计算的，因为这代表着，很可能同一个细胞感染了2个甚至更多的活性病毒颗粒。事实上，当阳性细胞百分比超过50%的时候，这种多重感染的可能性就比较高了，若直接计算，就会低估实际滴度。遇到这样的数值，剔除便是。
用什么细胞来测滴度，也是值得思考的一个问题。虽然网上许多方案用的是293T或者HCT116细胞作为宿主，但从准确度而言，我个人是不推荐的。慢病毒对不同细胞的感染能力是有区别的，而这个区别可大可小。我甚至发现，在同一个原始细胞系中分离出来的两个单克隆，对慢病毒的敏感性还有显着的区别。如果慢病毒是要用于诸如screening等要求高准确度的实验，请使用待screening的细胞作为宿主来测定滴度，这样才能保证*终测出来的活性滴度，是针对将要使用的细胞的。
2、抗生素筛选法
许多慢病毒载体并没有荧光报告基因，只有抗性筛选标记，这时我们只能用抗生素筛选来测定滴度了。
可能有的人会问，为何要将抗生素筛选法专门拎出来说？难道跟荧光报告基因法有很大的区别吗？
从原理上来说，两种方法并没有本质上的区别：它们都是计算阳性细胞的比例，从而换算原始的病毒活性滴度。但是，若细胞培养的时间较长，阳性细胞比例的变异度就会增大。
荧光报告基因法的实验流程较短，在感染48~72小时后，待荧光基因充分表达，即可测定。 然而，抗生素法则需要等抗性基因充分表达后，再加入抗生素筛选数天，待彻底杀灭阴性细胞后，才能进行细胞计数并换算滴度。无论*开始种植的细胞数量如何一致、细胞密度如何均一，人为误差和生物本身的变异度都是不可避免的。只要时间一长，微小的差异就会显现出来，*终导致每一组之间换算出来的滴度数值变异度增大。
此外，高剂量的病毒会给细胞的活性带来影响，或正面，或负面，这跟细胞本身对病毒的敏感性，以及所要表达的外源基因的性质，都有密切关系。总之，在较长时间培养的前提下，用高剂量组直接除以不加病毒的对照组得到的阳性细胞比例，不具有代表性。
Tips：在收获粗病毒后，建议额外分装几支90~100 ?l小体积管，和其他分装的大体积病毒一并置于-80℃保存。待这些小体积病毒结冰后，取出来融化，再测定滴度。这一步可以模拟一次冻融带来的活性滴度下降，这样*后测得的滴度才是真正具有参考价值的。
一、取舍的问题
在正式做实验之前，不妨先问自己这个问题：到底需不需要准确地测定慢病毒的滴度？
网上一搜，可以找到许多滴度测定的方案，也有不少商品化的试剂盒。这些方案各有优劣，但基本上都有这样一个规律：越准确，就越花时间。越省事的，就越不准确。但是，准确度对我们的实验来说，到底有多重要呢？
这个问题的答案，其实是跟我们使用病毒的实验目的密切相关的。如果这批慢病毒是用来建立稳定过表达编码基因或者shRNA等细胞系的，我觉得，根本没有必要对病毒的滴度进行细致地测定。至少我本人在这类情况下，是不测其准确滴度的。由于建立稳定细胞系，需要用抗生素筛选或者流式分选的方法，将阳性细胞挑出来，因此，即使感染效率没有达到100%，也并不要紧。
如果你是包装和使用慢病毒的新手，本司机建议在收了粗病毒上清后，分别在3个10-cm贴壁培养体系（或等同的悬浮培养体系）中，加入0.5、1、2 ml的病毒进行感染。*后，这其中总有一到两个皿满足使用，也比完整地走一套准确测定流程要省事许多。等熟练之后，大致摸清楚了自己的实验技术，以及外源基因长度和病毒活性滴度之间的关系，就不用设3个感染梯度做实验了。比如像基于pLKO表达shRNA这种很短的病毒基因组，在一个10-cm皿中我只加100-200 ?l。而如果是表达好几个kb的ORF，或者整个慢病毒质粒很大，我可能会加1 ml甚至更多。
二、快速测定法
当滴度准确性并不重要时，我们可以选择一些快速测定方案。不过，目前网上主流的实验技术指导文章，围绕这部分的内容都已相对陈旧。这其中包括PCR法测定病毒核酸量，ELISA法测定病毒外壳蛋白量。虽然相比我后面要讲的方法要快上得多，但这些实验一整套做下来，依然需要花费几个小时。
我目前使用的快速测定法，是用Clontech的Lenti-X GoStix试纸。它本质上也是测定病毒p24外壳蛋白量的方法，但相比传统的ELISA法来说，可要方便不少。当然，*后得到的结果，也不如ELISA法来得准确。只不过这种不准确性，是可以接受的。
具体的实验步骤是，在收获病毒之前，取20 ?l 293T细胞培养上清滴到试纸上，再滴加3-4滴Chase buffer，后静置5-10 min，等试剂均匀在试纸上展开后显色即可。只要在T那里有条带显示，就证明慢病毒粗上清达到可用滴度。
三、准确测定法
目前，所有的快速测定法都是不准确的，因为它们都没有考虑慢病毒的活性。也就是说，死病毒也会一并被测出来。在一些比较严格实验中，比如用慢病毒做RNAi-screening或CRISPR-screening，由于需要严格控制MOI，就需要测定慢病毒的准确滴度。
1、荧光报告基因法
对于携带荧光报告基因的慢病毒来说，测定起来可要简单得多。大致的实验流程是：
在6孔板中，均匀地种入1~3×10^5个细胞。可不等细胞贴壁，直接加入0、5、10、15、20、30 ?l粗病毒。若是纯化、浓缩的病毒，则按照浓缩比例，取一点点按比例重新回去，再按上述体积加入细胞中。可加入终浓度为2-10 ?g/ml的Polybrene。每孔培养基+细胞悬液+病毒+Polybrene的总体积为1.5-2 ml。
细胞贴壁，换液。
第三或第四天，用流式细胞术，或者荧光显微镜（可用Hoechst 33342染总细胞），计算各剂量组带荧光的细胞比例，就可以换算出原始的平均病毒滴度。如果天加入的病毒是稀释过的，记得将算出来的数值再乘一下稀释倍数。具体的公式就不用啰嗦了吧，小学初中的数学题而已。
值得注意的是，当病毒滴度较高时，很容易在高剂量组中达到100%阳性。这样的数据是不可以参与平均滴度计算的，因为这代表着，很可能同一个细胞感染了2个甚至更多的活性病毒颗粒。事实上，当阳性细胞百分比超过50%的时候，这种多重感染的可能性就比较高了，若直接计算，就会低估实际滴度。遇到这样的数值，剔除便是。
用什么细胞来测滴度，也是值得思考的一个问题。虽然网上许多方案用的是293T或者HCT116细胞作为宿主，但从准确度而言，我个人是不推荐的。慢病毒对不同细胞的感染能力是有区别的，而这个区别可大可小。我甚至发现，在同一个原始细胞系中分离出来的两个单克隆，对慢病毒的敏感性还有显着的区别。如果慢病毒是要用于诸如screening等要求高准确度的实验，请使用待screening的细胞作为宿主来测定滴度，这样才能保证*终测出来的活性滴度，是针对将要使用的细胞的。
2、抗生素筛选法
许多慢病毒载体并没有荧光报告基因，只有抗性筛选标记，这时我们只能用抗生素筛选来测定滴度了。
可能有的人会问，为何要将抗生素筛选法专门拎出来说？难道跟荧光报告基因法有很大的区别吗？
从原理上来说，两种方法并没有本质上的区别：它们都是计算阳性细胞的比例，从而换算原始的病毒活性滴度。但是，若细胞培养的时间较长，阳性细胞比例的变异度就会增大。
荧光报告基因法的实验流程较短，在感染48~72小时后，待荧光基因充分表达，即可测定。 然而，抗生素法则需要等抗性基因充分表达后，再加入抗生素筛选数天，待彻底杀灭阴性细胞后，才能进行细胞计数并换算滴度。无论*开始种植的细胞数量如何一致、细胞密度如何均一，人为误差和生物本身的变异度都是不可避免的。只要时间一长，微小的差异就会显现出来，*终导致每一组之间换算出来的滴度数值变异度增大。
此外，高剂量的病毒会给细胞的活性带来影响，或正面，或负面，这跟细胞本身对病毒的敏感性，以及所要表达的外源基因的性质，都有密切关系。总之，在较长时间培养的前提下，用高剂量组直接除以不加病毒的对照组得到的阳性细胞比例，不具有代表性。
Tips：在收获粗病毒后，建议额外分装几支90~100 ?l小体积管，和其他分装的大体积病毒一并置于-80℃保存。待这些小体积病毒结冰后，取出来融化，再测定滴度。这一步可以模拟一次冻融带来的活性滴度下降，这样*后测得的滴度才是真正具有参考价值的。
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