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微生物常用染色法及染色制备介绍
阅读次数：258 发布时间：2023/10/12 11:19:21
微生物染色的基本原理，是借助物理因素和化学因素的作用而进行的。物理因素如细胞及细胞物质对染料的毛细现象、渗透、吸附作用等。化学因素则是根据细胞物质和染料的不同性质而发生地各种化学反应。酸性物质对于碱性染料较易吸附，且吸附作用稳固；同样，碱性物质对酸性染料较易于吸附。如酸性物质细胞核对于碱性染料就有化学亲和力，易于吸附。但是，要使酸性物质染上酸性材料，必须把它们的物理形式加以改变（如改变pH值），才利于吸附作用的发生。相反，碱性物质（如细胞质）通常仅能染上酸性染料，若把它们变为适宜的物理形式，也同样能与碱性染料发生吸附作用。
常用染色法
单染色法
只用一种染料染色。由于大多数细菌胞浆内含有酸性物质，可与碱性染料结合，故常用吕氏美蓝、结晶紫和稀释石碳酸复红等染液。此法可观察细菌的大小、形态与排列，不能显示细菌的结构与染色特性。
2.复染色法
用两种或两种以上不同染料可将细菌染成不同的颜色，除可观察细菌的大小、形态与排列外，还反应出细菌染色特性，具有鉴别细菌种类的价值。常用的有革兰染色法和抗酸染色法。
(1)革兰染色：①细菌涂片经火焰固定，加结晶紫染液染1min，清水冲去染液。②加碘液媒染 1min，水洗，甩干。③用95%乙醇脱色，轻轻摇动约30s，至无紫色洗落为止，水洗，甩干。④加稀释石碳酸复红或沙黄染液数滴进行复染，约30s，水洗。⑤干后显微镜下镜检观察结果，革兰阳性菌染成紫色，革兰阴性菌为红色。
(2)抗酸染色：萋-尼 (Ziehl-Neelse)抗酸染色法：
①细菌涂片经火焰固定，加石炭酸复红溶液，徐徐加热至有蒸气出现，切不可沸腾。染液因蒸发减少时，应随时补充，防止染液蒸干。持续染5min(奴卡菌需要加长时间)，水洗，甩干。
②滴加3%盐酸乙醇脱色，不时摇动玻片至无红色脱落为止，水洗，甩干。
③加吕氏美蓝复染液数滴复染1min，水洗。
④干后显微镜下镜检观察结果，抗酸杆菌染成红色，非抗酸杆菌为蓝色。
金胺O-罗丹明B染色法：①细菌涂片固定后加第1液30——90s。②弃去第1液后加第2液染15min。③用第3液脱色1——2min，水洗。④滴加第4液染30s，水洗，
⑤干后置荧光显微镜下镜检观察结果 在淡蓝色背景下，抗酸杆菌呈红色，其它细菌和细胞呈蓝色。
3.特殊染色法
(1)鞭毛染色(改良Ryu法)：
①玻片的处理 将新载玻片浸泡在95%乙醇中。临用时取出，以干净纱布擦干。
②在玻片上滴蒸馏水1滴。
③挑取培养物少许，轻触蒸馏水滴顶部，仅允许少量细菌进入水滴，不可搅动，以免鞭毛脱落。④置35℃孵箱自然干燥，不能用火焰固定，滴加鞭毛染液染1——2 min轻轻水洗。
⑤干后显微镜镜检观察结果 鞭毛和菌体呈紫色。
(2)异染颗粒染色(阿尔培托法)：
①细菌涂片经火焰固定，加甲液染色3——5min。水洗。
②滴加乙液，染1min。水洗。
③干后显微镜镜检观察结果 菌体呈绿色，异染颗粒呈蓝黑色,用于白喉棒状杆菌染色。
(3)荚膜染色：
①奥尔特荚膜染色法：将已固定的细菌涂片滴加3%沙黄染液，用火焰加温染色，持续3min，冷却后水洗，待干镜检。结果：菌体呈褐色，荚膜呈黄色，此法主要用于碳疽芽胞杆菌。
②Hiss氏硫酸铜法：染液：液为结晶紫乙醇饱和液5ml加蒸馏水95ml 的混合液;第二液为20%硫酸铜水溶液。方法：细菌涂片自然干燥，乙醇固定。滴加液，微加热染1min。再用第二液将涂片上的染液洗去，勿再水洗，倾去硫酸铜液，以吸水纸吸干镜检。结果：菌体及背景呈紫色，荚膜呈鲜蓝色或不着色。
(4)芽胞染色：
染液：液为萋-纳氏石炭酸复红液，第二液为95%乙醇，第三液为碱性美蓝液。
方法：将已固定的细菌涂片滴加液，微加热染5min，冷却后水洗。用第二液脱色2min，水洗。加第三液复染1min，水洗，待干镜检。结果：菌体呈蓝色，芽胞呈红色。
4.负染色法
背景着色而菌体本身不着色的染色为负染色法。常见的是墨汁负染色法，用来观察真菌及细菌荚膜等。在标本涂片处滴加染液，混合后加上盖玻片(勿产生气泡)，轻压。在低倍镜下寻找有荚膜的菌细胞，转高倍镜或油镜确认，如新型隐球菌可见宽厚透亮的荚膜，背景为黑色。
5.荧光染色法
经荧光素染色的细菌，或荧光素标记的荧光抗体与相应抗原的细菌、病毒结合形成的复合物，在荧光显微镜下发出荧光。
细菌染色的一般程序
细菌染色的一般程序是：涂片(干燥)—固定—染色(媒染)—(脱色)—(复染)。
涂片制备
血液、分泌物、排泄物、穿刺液和液体培养物，直接在载玻片上作薄膜涂片;尸检或感染动物组织，病变局部涂抹采样的棉拭子直接涂片。固体培养基上的菌落或菌苔的制片，先用接种环取一环生理盐水置载玻片中央，再用无菌接种环取少量的培养物在生理盐水中磨匀，涂布成1cm2大小的涂面，置室温下自然干燥或远火慢慢烘干。
2.固定
目的是杀死细菌，凝固细菌蛋白及结构，便于染色;促使细菌粘附在载玻片上，避免在水洗过程中被水冲掉;改变细菌对染料的通透性，有利于菌细胞内结构的染色。通常用火焰加热固定，将已干燥的涂片在火焰中迅速通过3次，以手背皮肤接触玻片不烫为佳。
3.染色
根据检验目的不同，选择不同的染色方法进行染色。染色时滴加染液，以复盖标本为度。
4.媒染
凡能增强染料和被染物的亲和力，使染料固定于被染物及能引起细胞膜通透性改变的物质，称媒染剂。常用的有明矾、鞣酸、金属盐和碘等，也有用加热法促进着色。媒染剂可用于初染与复染之间，也可用于固定之后或含于固定液、染色中。
5.脱色
凡能使已着色的被染物脱去颜色的化学试剂称为脱色剂。常用乙醇、丙酮等作为脱色剂。脱色剂可以查出细菌与染料结合的稳定程度，作为鉴别染色之用。
6.复染
已脱色处理的细菌或其结构常以复染液作复染以便于观察。复染液与初染液的颜色不同而成一鲜明对比。复染不宜太强，以免掩盖初染的颜色。
主要用于厌养菌动力的检查。通常选用60——70mm长。0.5——1.0mm孔径的毛细管虹吸厌养菌悬液后，用火焰将毛细管两端熔封。并用塑胶纸将毛细管固定在载玻片上，置高倍镜下暗视野观察。
单染色法
只用一种染料染色。由于大多数细菌胞浆内含有酸性物质，可与碱性染料结合，故常用吕氏美蓝、结晶紫和稀释石碳酸复红等染液。此法可观察细菌的大小、形态与排列，不能显示细菌的结构与染色特性。
2.复染色法
用两种或两种以上不同染料可将细菌染成不同的颜色，除可观察细菌的大小、形态与排列外，还反应出细菌染色特性，具有鉴别细菌种类的价值。常用的有革兰染色法和抗酸染色法。
(1)革兰染色：①细菌涂片经火焰固定，加结晶紫染液染1min，清水冲去染液。②加碘液媒染 1min，水洗，甩干。③用95%乙醇脱色，轻轻摇动约30s，至无紫色洗落为止，水洗，甩干。④加稀释石碳酸复红或沙黄染液数滴进行复染，约30s，水洗。⑤干后显微镜下镜检观察结果，革兰阳性菌染成紫色，革兰阴性菌为红色。
(2)抗酸染色：萋-尼 (Ziehl-Neelse)抗酸染色法：
①细菌涂片经火焰固定，加石炭酸复红溶液，徐徐加热至有蒸气出现，切不可沸腾。染液因蒸发减少时，应随时补充，防止染液蒸干。持续染5min(奴卡菌需要加长时间)，水洗，甩干。
②滴加3%盐酸乙醇脱色，不时摇动玻片至无红色脱落为止，水洗，甩干。
③加吕氏美蓝复染液数滴复染1min，水洗。
④干后显微镜下镜检观察结果，抗酸杆菌染成红色，非抗酸杆菌为蓝色。
金胺O-罗丹明B染色法：①细菌涂片固定后加第1液30——90s。②弃去第1液后加第2液染15min。③用第3液脱色1——2min，水洗。④滴加第4液染30s，水洗，
⑤干后置荧光显微镜下镜检观察结果 在淡蓝色背景下，抗酸杆菌呈红色，其它细菌和细胞呈蓝色。
3.特殊染色法
(1)鞭毛染色(改良Ryu法)：
①玻片的处理 将新载玻片浸泡在95%乙醇中。临用时取出，以干净纱布擦干。
②在玻片上滴蒸馏水1滴。
③挑取培养物少许，轻触蒸馏水滴顶部，仅允许少量细菌进入水滴，不可搅动，以免鞭毛脱落。④置35℃孵箱自然干燥，不能用火焰固定，滴加鞭毛染液染1——2 min轻轻水洗。
⑤干后显微镜镜检观察结果 鞭毛和菌体呈紫色。
(2)异染颗粒染色(阿尔培托法)：
①细菌涂片经火焰固定，加甲液染色3——5min。水洗。
②滴加乙液，染1min。水洗。
③干后显微镜镜检观察结果 菌体呈绿色，异染颗粒呈蓝黑色,用于白喉棒状杆菌染色。
(3)荚膜染色：
①奥尔特荚膜染色法：将已固定的细菌涂片滴加3%沙黄染液，用火焰加温染色，持续3min，冷却后水洗，待干镜检。结果：菌体呈褐色，荚膜呈黄色，此法主要用于碳疽芽胞杆菌。
②Hiss氏硫酸铜法：染液：液为结晶紫乙醇饱和液5ml加蒸馏水95ml 的混合液;第二液为20%硫酸铜水溶液。方法：细菌涂片自然干燥，乙醇固定。滴加液，微加热染1min。再用第二液将涂片上的染液洗去，勿再水洗，倾去硫酸铜液，以吸水纸吸干镜检。结果：菌体及背景呈紫色，荚膜呈鲜蓝色或不着色。
(4)芽胞染色：
染液：液为萋-纳氏石炭酸复红液，第二液为95%乙醇，第三液为碱性美蓝液。
方法：将已固定的细菌涂片滴加液，微加热染5min，冷却后水洗。用第二液脱色2min，水洗。加第三液复染1min，水洗，待干镜检。结果：菌体呈蓝色，芽胞呈红色。
4.负染色法
背景着色而菌体本身不着色的染色为负染色法。常见的是墨汁负染色法，用来观察真菌及细菌荚膜等。在标本涂片处滴加染液，混合后加上盖玻片(勿产生气泡)，轻压。在低倍镜下寻找有荚膜的菌细胞，转高倍镜或油镜确认，如新型隐球菌可见宽厚透亮的荚膜，背景为黑色。
5.荧光染色法
经荧光素染色的细菌，或荧光素标记的荧光抗体与相应抗原的细菌、病毒结合形成的复合物，在荧光显微镜下发出荧光。
细菌染色的一般程序
细菌染色的一般程序是：涂片(干燥)—固定—染色(媒染)—(脱色)—(复染)。
涂片制备
血液、分泌物、排泄物、穿刺液和液体培养物，直接在载玻片上作薄膜涂片;尸检或感染动物组织，病变局部涂抹采样的棉拭子直接涂片。固体培养基上的菌落或菌苔的制片，先用接种环取一环生理盐水置载玻片中央，再用无菌接种环取少量的培养物在生理盐水中磨匀，涂布成1cm2大小的涂面，置室温下自然干燥或远火慢慢烘干。
2.固定
目的是杀死细菌，凝固细菌蛋白及结构，便于染色;促使细菌粘附在载玻片上，避免在水洗过程中被水冲掉;改变细菌对染料的通透性，有利于菌细胞内结构的染色。通常用火焰加热固定，将已干燥的涂片在火焰中迅速通过3次，以手背皮肤接触玻片不烫为佳。
3.染色
根据检验目的不同，选择不同的染色方法进行染色。染色时滴加染液，以复盖标本为度。
4.媒染
凡能增强染料和被染物的亲和力，使染料固定于被染物及能引起细胞膜通透性改变的物质，称媒染剂。常用的有明矾、鞣酸、金属盐和碘等，也有用加热法促进着色。媒染剂可用于初染与复染之间，也可用于固定之后或含于固定液、染色中。
5.脱色
凡能使已着色的被染物脱去颜色的化学试剂称为脱色剂。常用乙醇、丙酮等作为脱色剂。脱色剂可以查出细菌与染料结合的稳定程度，作为鉴别染色之用。
6.复染
已脱色处理的细菌或其结构常以复染液作复染以便于观察。复染液与初染液的颜色不同而成一鲜明对比。复染不宜太强，以免掩盖初染的颜色。
主要用于厌养菌动力的检查。通常选用60——70mm长。0.5——1.0mm孔径的毛细管虹吸厌养菌悬液后，用火焰将毛细管两端熔封。并用塑胶纸将毛细管固定在载玻片上，置高倍镜下暗视野观察。
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