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PCR反应的核心成份——DNA聚合酶的选择

阅读次数：215 发布时间：2024/3/13 10:26:50

　　PCR即聚合酶链式反应，对于常年狂奔在实验室的实验人来说并不陌生。那么，对于PCR反应的核心成份，DNA聚合酶，你选对了吗？

　　常见的 DNA 聚合酶如 Taq、Phanta、Pfu、KOD、Primerstar、Klenow、Bst、Phi29 等等。根据耐热性来分可分为耐热酶和常温酶。耐热聚合酶如 Taq、Pfu、KOD、Primerstar 等，常温聚合酶包括 Klenow、Bst、Phi29 等。根据保真度来分，高保真聚合酶 Pfu、KOD、Phanta 等，普通聚合酶 Taq 等。

　　DNA聚合酶的功能

　　1）通过核苷酸聚合反应，使DNA链沿5’→3’方向延长（DNA聚合酶活性）[1]

　　2）催化由3’端水解DNA链（3’→ 5’核酸外切酶活性，用于切除错配的碱基）[1]

　　3）催化由5’端水解DNA链（5’→ 3’核酸外切酶活性，用于切除引物）[1]

　　4）催化由3’端使DNA链发生焦磷酸解

　　5）催化无机焦磷酸盐与脱氧核糖核苷酸三磷酸之间的焦磷酸基的交换

　　面对如此之多的选择，大多数刚进实验室的新生们默默表示，选择恐惧症，犯了……

　　那么，解决的方法是，根据实验目的选择合适的 DNA 聚合酶。比如：常规的 PCR 扩增和菌液鉴定，长度小于 5kb 的片段，保真度要求不高，使用 Taq 酶扩增即可。选用 Mix 的形式，混样更加简单，操作更加便捷。如果混样泡沫多，想灭掉泡沫的话，推荐大家使用 Green Taq Mix。想要获得较高的产量，可以选择 Taq Plus DNA 聚合酶，相对于 Taq 酶扩增性能更强。

　　1. 选择热启动酶降低非特异性扩增

　　在使用 Taq 酶进行扩增时，有时会出现非特异性扩增，可能的原因可以从模板、引物、体系、程序中一一排查。如模板是否被污染，引物特异性如何，Mg2+浓度偏高等等，其中一个不可忽视的原因是 DNA 聚合酶的种类是否合适。如果排查了其它原因仍旧有非特异性产物，可以选择热启动酶重新实验，即可有效减少或消除体系中其它产物的积累。常用的热启动酶分为两类：一类是化学法修饰的热启动酶，如 Ace Taq ，预变性 95℃5 - 10 min 即可释放酶活；一类是抗体法修饰的热启动酶，如 Champagne Taq ，预变性 95℃30s 即可释放酶活。使用时注意预变性时间，方能获得满意的扩增效果。

　　2. 选择 Lamp 扩增长片段

　　大于 5Kb 的长片段又该如何扩增呢？如果实验对保真度的需求不高，那么就可以使用 LAmp DNA 聚合酶。其保真度是 Taq 酶的 6 倍，可扩增超过 20Kb 的基因组、cDNA 片段，对于低拷贝、低纯度、以及不同 GC 含量的模板都具有很高的成功率。

　　3. 选择高保真酶快速高效扩增

　　如果实验对保真度要求较高，在选择 DNA 聚合酶的时候就需要使用高保真酶，如 Pfu、KOD、Primerstar、Phanta 等。三者都属于代高保真酶，已在市场中广泛使用。诺唯赞科研团队的大力改造生产的 Phanta 系列的高保真酶，保真度达到了 Taq 酶的 50 倍，扩增性能、扩增长度、产量、模板适应性都显著提升。Phanta Max 保真度是 Taq 酶的 53 倍，Pfu 的 6 倍，对于质粒等简单模板有效扩增长度可达 40kb，cDNA 有效扩增长度可达 10kb，基因组有效扩增长度可达 20kb，适合于各种 GC 含量的扩增，可用于多种样本的直接 PCR 如植物叶片、全血等。且扩增仅需 30s/kb，甚至于 2kb/s。如此卓越，爱不释手了吧？

　　4. 选择直接扩增试剂盒对粗品扩增

　　xxx生产的各种直扩试剂盒，直接对粗品进行扩增，大大减少了实验的工作周期。如小鼠基因型鉴定可以直接使用 One Step Mouse Genotyping Kit，全血扩增可以直接使用 Blood Direct PCR Kit V2。