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流式细胞术(FCM)实验原理与应用详解
阅读次数：192 发布时间：2024/3/25 10:32:05
流式细胞术：即FCM。很多小伙伴在做实验过程中会碰到很多问题，比如：无信号、荧光强度高等一系列问题，接下来就来聊聊流式细胞技术！
目，流式细胞术广泛应用于细胞表面和细胞内分子表达特征的分析，界定不同种类的细胞群，测定分离出的亚类纯度，分析细胞的大小和总量，它可以同时分析单个细胞的多个参数。它主要用于检测标记在抗体上的荧光强度，这些荧光抗体则可以检测与特定细胞分子结合的蛋白或配体，如与 DNA 结合的溴化丙啶 (PI) 等。
实验原理
待测样品(如细胞、染色体、精子或细菌等)经荧光染料染色后制成样品悬液，在一定压力下通过壳液包围的进样管而进入流动室，排成单列的细胞，由流动室的喷嘴喷出而成为细胞液流，并与入射激光束相交。细胞被激发而产生荧光，由放在与入射的激光束和细胞液流成 90°处的光学系统收集之。光学系统中的阻断滤片用于阻挡激发光；二色分光镜及另一些阻断滤片则用于选择荧光波长。荧光检测器为光电倍增管。散射光检测器是光电二管，用以收集向散射光。小角度向散射与细胞大小有关。
临床应用
1、 细胞生物学研究
流式细胞术可用于测定细胞周期各时相细胞的百分比。通过测定细胞群体中每个细胞的DNA含量，得出DNA含量分布曲线。同时可进行多参数分析，即同时测定一个细胞的多种性质。如散射光和荧光，或多种不同颜色的荧光。此外,流式细胞术还可测定细胞群体同步化的程度和所处的时期，鉴别死细胞和活细胞，利用荧光标记配体，还可定量测定细胞表面和内部的受体等。是研究DNA合成和细胞周期的一种非常有用的技术。
2、细胞免疫学
结合免疫荧光方法，流式细胞术可辨认和计数带有不同表面特异性抗原的细胞，此外，流式细胞术还可用于定量分析结合于细胞上的荧光素标记的外源凝集素，测定细胞表面积和荧光素结合位点的相对密度，结合细胞动力学测定每个细胞结合位点的数目，以及研究各种外源凝集素与细胞表面结合的竞争性等。
3、肿瘤学
应用主要是通过测DNA含量实现的，包括癌病变检查、早期癌变的检出、化疗指导以及预后评估等。
正常细胞均是DNA二倍体，当细胞癌基因表达或者由良性的肿瘤细胞转变成恶性肿瘤细胞时，这些细胞中DNA水平会发生改变，这些细胞的DNA倍体变化或者染色体结构异常在FCM检测过程中会以DNA倍体数量的改变表现出来。FCM对DNA异倍体精确的分析是肿瘤诊断、间叶组织良恶性肿瘤判断的重要依据。利用FCM还可以测定肿瘤细胞的增殖活性、分化程度和凋亡水平，这些细胞参数与肿瘤的恶性程度密切相关，并为肿瘤临床治疗方案的选择提供可靠的理论基础。
4、遗传学
用流式细胞术测定染色体DNA含量,可得到染色体频率分布图，称为流式染色体核型分析。同类型染色体出现一个峰，峰的面积代表这种类型染色体的丰度。流式染色体核型分析技术不仅能快速分析核型，而且能分选出不同类型的染色体,做成人类每条染色体的DNA文库，可用于人类基因组研究、遗传病和癌症的诊断的研究。
常见问题及解答
问题：无信号/荧光强度弱
问题分析：
1、 不正确的信号补偿
2、 没有足够的抗体来检测:增加抗体的量/浓度；
3、 无法接近细胞内目标:检查目标蛋白是否在细胞内。
4、 细胞内染色结合荧光分子太大
5、 激光器未对齐
6、 目标蛋白不存在或处于低水平表达
7、 可溶性或分泌型目标蛋白
8、 一抗和二抗不匹配
9、 荧光分子的荧光逐渐消退
解决方法
1、 确保所有的抗体都按照厂商的说明书正确存储。
2、确保商品化抗体没有超过有效期。
3、 确保已正确加入足量的抗体。
4、确保抗体已连接荧光素。如果未连接荧光素，需加入连接有荧光素的二抗。
5、使用了正确的二抗，就是说二抗能够识别你的一抗。
6、检测的是PE或APC荧光素的抗体，确保该抗体未被冰冻过。
7、检测的组织上是否表达该抗原？可查看相关文献了解该抗原的表达情况，或者同时做一个阳性对照。
问题：荧光强度过高
问题分析：
1、 抗体浓度过高
2、 过量抗体被困
3、 封闭不足
解决方法：
1、 减少每个样本中加入的抗体量；
2、 确保洗涤步骤充分，包括在洗涤缓冲液中加入吐温或 Triton；
3、 与封闭步骤一样，抗体中加入1-3% 封闭试剂；
问题：观察到两个或多个细胞群但应该只有一群细胞
问题分析：
1、 不止一类细胞表达目的蛋白
2、 出现细胞双峰
3、 侧向散射背景偏高（来自小颗粒）
4、 细胞裂解
5、 细菌污染
解决方法：
1、 确保细胞充分分离；
2、 染色轻轻地混合细胞，在放入流式细胞仪用吸管再次混匀，也可以筛选或过滤细胞以除去团块
3、 样品应是新鲜的并且是正确制备的。细胞不能高转速离心或剧烈震荡；
问题：结果与预期相反
问题分析：
1、 有些试剂可能会影响某些抗原检测，例如EDTA可影响一些血小板标记的检测。
2、 裂解液也可以影响一些抗原检测
3、 有些抗原是表达在胞内的
解决方法：
1、 可采用PBMC提取法
2、 需选择正确的破膜剂进行正确的破膜处理。
目，流式细胞术广泛应用于细胞表面和细胞内分子表达特征的分析，界定不同种类的细胞群，测定分离出的亚类纯度，分析细胞的大小和总量，它可以同时分析单个细胞的多个参数。它主要用于检测标记在抗体上的荧光强度，这些荧光抗体则可以检测与特定细胞分子结合的蛋白或配体，如与 DNA 结合的溴化丙啶 (PI) 等。
实验原理
待测样品(如细胞、染色体、精子或细菌等)经荧光染料染色后制成样品悬液，在一定压力下通过壳液包围的进样管而进入流动室，排成单列的细胞，由流动室的喷嘴喷出而成为细胞液流，并与入射激光束相交。细胞被激发而产生荧光，由放在与入射的激光束和细胞液流成 90°处的光学系统收集之。光学系统中的阻断滤片用于阻挡激发光；二色分光镜及另一些阻断滤片则用于选择荧光波长。荧光检测器为光电倍增管。散射光检测器是光电二管，用以收集向散射光。小角度向散射与细胞大小有关。
临床应用
1、 细胞生物学研究
流式细胞术可用于测定细胞周期各时相细胞的百分比。通过测定细胞群体中每个细胞的DNA含量，得出DNA含量分布曲线。同时可进行多参数分析，即同时测定一个细胞的多种性质。如散射光和荧光，或多种不同颜色的荧光。此外,流式细胞术还可测定细胞群体同步化的程度和所处的时期，鉴别死细胞和活细胞，利用荧光标记配体，还可定量测定细胞表面和内部的受体等。是研究DNA合成和细胞周期的一种非常有用的技术。
2、细胞免疫学
结合免疫荧光方法，流式细胞术可辨认和计数带有不同表面特异性抗原的细胞，此外，流式细胞术还可用于定量分析结合于细胞上的荧光素标记的外源凝集素，测定细胞表面积和荧光素结合位点的相对密度，结合细胞动力学测定每个细胞结合位点的数目，以及研究各种外源凝集素与细胞表面结合的竞争性等。
3、肿瘤学
应用主要是通过测DNA含量实现的，包括癌病变检查、早期癌变的检出、化疗指导以及预后评估等。
正常细胞均是DNA二倍体，当细胞癌基因表达或者由良性的肿瘤细胞转变成恶性肿瘤细胞时，这些细胞中DNA水平会发生改变，这些细胞的DNA倍体变化或者染色体结构异常在FCM检测过程中会以DNA倍体数量的改变表现出来。FCM对DNA异倍体精确的分析是肿瘤诊断、间叶组织良恶性肿瘤判断的重要依据。利用FCM还可以测定肿瘤细胞的增殖活性、分化程度和凋亡水平，这些细胞参数与肿瘤的恶性程度密切相关，并为肿瘤临床治疗方案的选择提供可靠的理论基础。
4、遗传学
用流式细胞术测定染色体DNA含量,可得到染色体频率分布图，称为流式染色体核型分析。同类型染色体出现一个峰，峰的面积代表这种类型染色体的丰度。流式染色体核型分析技术不仅能快速分析核型，而且能分选出不同类型的染色体,做成人类每条染色体的DNA文库，可用于人类基因组研究、遗传病和癌症的诊断的研究。
常见问题及解答
问题：无信号/荧光强度弱
问题分析：
1、 不正确的信号补偿
2、 没有足够的抗体来检测:增加抗体的量/浓度；
3、 无法接近细胞内目标:检查目标蛋白是否在细胞内。
4、 细胞内染色结合荧光分子太大
5、 激光器未对齐
6、 目标蛋白不存在或处于低水平表达
7、 可溶性或分泌型目标蛋白
8、 一抗和二抗不匹配
9、 荧光分子的荧光逐渐消退
解决方法
1、 确保所有的抗体都按照厂商的说明书正确存储。
2、确保商品化抗体没有超过有效期。
3、 确保已正确加入足量的抗体。
4、确保抗体已连接荧光素。如果未连接荧光素，需加入连接有荧光素的二抗。
5、使用了正确的二抗，就是说二抗能够识别你的一抗。
6、检测的是PE或APC荧光素的抗体，确保该抗体未被冰冻过。
7、检测的组织上是否表达该抗原？可查看相关文献了解该抗原的表达情况，或者同时做一个阳性对照。
问题：荧光强度过高
问题分析：
1、 抗体浓度过高
2、 过量抗体被困
3、 封闭不足
解决方法：
1、 减少每个样本中加入的抗体量；
2、 确保洗涤步骤充分，包括在洗涤缓冲液中加入吐温或 Triton；
3、 与封闭步骤一样，抗体中加入1-3% 封闭试剂；
问题：观察到两个或多个细胞群但应该只有一群细胞
问题分析：
1、 不止一类细胞表达目的蛋白
2、 出现细胞双峰
3、 侧向散射背景偏高（来自小颗粒）
4、 细胞裂解
5、 细菌污染
解决方法：
1、 确保细胞充分分离；
2、 染色轻轻地混合细胞，在放入流式细胞仪用吸管再次混匀，也可以筛选或过滤细胞以除去团块
3、 样品应是新鲜的并且是正确制备的。细胞不能高转速离心或剧烈震荡；
问题：结果与预期相反
问题分析：
1、 有些试剂可能会影响某些抗原检测，例如EDTA可影响一些血小板标记的检测。
2、 裂解液也可以影响一些抗原检测
3、 有些抗原是表达在胞内的
解决方法：
1、 可采用PBMC提取法
2、 需选择正确的破膜剂进行正确的破膜处理。
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